大鼠γ干擾素（INF-γ）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定大鼠血清，血漿及相關液體樣本中γ干擾素（INF-γ）的含量。
實驗原理：
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠γ干擾素（INF-γ）水平。用純化的大鼠γ干擾素（INF-γ）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入γ干擾素（INF-γ），再與HRP標記的γ干擾素（INF-γ）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的γ干擾素（INF-γ）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中大鼠γ干擾素（INF-γ）濃度。
試劑盒組成：
試劑盒組成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
說明書 | 1份 | 1份 | |
封板膜 | 2片（48） | 2片（96） | |
密封袋 | 1個 | 1個 | |
酶標包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
標準品1：125ng/L 標準品2：250ng/L 標準品3：500ng/L 標準品4：1000ng/L 標準品5：2000ng/L 標準品6：4000ng/L | 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 | 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
酶標試劑 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
樣品稀釋液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑A液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑B液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
終止液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
濃縮洗滌液 | （20ml×20倍）×1瓶 | （20ml×30倍）×1瓶 | 2-8℃保存 |
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。
2. 血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?/span>2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟：
- 加標準品：在酶標包被板上設標準品孔12孔，濃度依次由低到高或者由高到低，每孔加標準50ul，每個濃度做兩個平行孔。
- 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
- 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
- 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。
- 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
- 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
- 溫育：操作同3。
- 洗滌：操作同5。
- 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
- 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
- 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。
注意事項：
- 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
- 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
- 各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
- 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
- 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
- 底物請避光保存。
- 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
- 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
- 本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
計算：
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.92以上。
2.批內(nèi)與批見應分別小于9%和15%
檢測范圍：
30ng/L -4000ng/L
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：2-8℃。
2．有效期：6個月
