一、制片和染色的基本程序

　　微生物的染色方法很多，各種方法應(yīng)用的染料也不盡相同，但是一般染色都要通過制片及一套染色操作程序。

　　1、制片

　　在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水，用接種環(huán)進(jìn)行無菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層，為避免因菌數(shù)過多聚成集團(tuán)，不利觀察個(gè)體形態(tài)，可在載玻片之一側(cè)再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進(jìn)行稀釋，涂布成薄層，若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可。

　　2、自然干燥

　　涂片在室溫下使其自然干燥，有時(shí)為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。

　　3、固定

　　標(biāo)本干燥后即進(jìn)行固定，固定的目的有三個(gè)：

　　１）殺死微生物，固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

　　２）保證菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標(biāo)本被水沖洗掉。

　　３）改變?nèi)玖蠈?duì)細(xì)胞的通透性，因?yàn)樗赖脑|(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色。

　　固定常常利用高溫，手執(zhí)載玻片的一端（涂有標(biāo)本的遠(yuǎn)端），標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3—4次，共約2—3秒鐘，并不時(shí)以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進(jìn)行染色。

　　以上這種固定法在微生物實(shí)驗(yàn)室中雖然應(yīng)用較多普遍，但是應(yīng)當(dāng)指出，在研究微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)時(shí)不適用，應(yīng)采用化學(xué)固定法。化學(xué)固定法zui常用的固定劑有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，1—2%的餓酸等。餓酸能很快固定細(xì)胞但不改變其結(jié)構(gòu)，故較常用。應(yīng)用餓酸固定細(xì)胞的技術(shù)如下：在培養(yǎng)皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛細(xì)管，在毛細(xì)管中注入少量的1—2%餓酸溶液，同時(shí)在玻璃上再放置濕標(biāo)本涂片的載玻片，然后把培養(yǎng)皿蓋上，經(jīng)過1—2分鐘后把標(biāo)本從培養(yǎng)皿中取出，并使之干燥。

　　4、染色

　　標(biāo)本固定后，滴加染色液。染色的時(shí)間各不相同，視標(biāo)本與染料的性質(zhì)而定，有時(shí)染色時(shí)還要加熱。染料作用標(biāo)本的時(shí)間平均約1—3分鐘，而所有的染色時(shí)間內(nèi)，整個(gè)涂片（或有標(biāo)本的部分）應(yīng)該浸在染料之中。

　　若作復(fù)合染色，在媒染處理時(shí)，媒染劑與染料形成不溶性化合物，可增加染料和細(xì)菌的親和力。一般固定后媒染，但也可以結(jié)合固定或染色同時(shí)進(jìn)行。

　　５、脫色

　　用醇類或酸類處理染色的細(xì)胞，使之脫色。可檢查染料與細(xì)胞結(jié)合的穩(wěn)定程度，鑒別不同種類的細(xì)菌。常用的脫色劑是95%酒精和3%鹽酸溶液。

　　６、復(fù)染

　　脫色后再用一種染色劑進(jìn)行染色，與不被脫色部位形成鮮明的對(duì)照，便于觀察。革氏染色在酒精脫色后用番紅，石碳酸復(fù)紅zui后進(jìn)行染色，就是復(fù)染。

　　７、水洗

　　染色到一定的時(shí)候，用細(xì)小的水流從標(biāo)本的背面把多余的染料沖洗掉，被菌體吸附的染料則保留。

　　８、干燥

　　著色標(biāo)本洗凈后，將標(biāo)本晾干，或用吸水紙把多余的水吸去，然后晾干或微熱烘干，用吸水紙時(shí)，切勿使載玻片翻轉(zhuǎn)，以免將菌體擦掉。

　　９、鏡檢

　　干燥后的標(biāo)本可用顯微鏡觀察。

　　綜上所述，染色的基本程序如下：

　　制片→固定→媒染→染色→脫色→復(fù)染→水洗→干燥→鏡檢。

　　二、染色方法

　　微生物染色方法一般分為單染色法和復(fù)染色法兩種。前者用一種染料使微生物染色，但不能鑒別微生物。復(fù)染色法是用兩種或兩種以上染料，有協(xié)助鑒別微生物的作用。故亦稱鑒別染色法。常用的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法，此外還有鑒別細(xì)胞各部分結(jié)構(gòu)的（如芽胞、鞭毛、細(xì)胞核等）特殊染色法。食品微生物檢驗(yàn)中常用的是單染色法和革蘭氏染色法。

　　１、單染色法

　　用一種染色劑對(duì)涂片進(jìn)行染色，簡便易行，適于進(jìn)行微生物的形態(tài)觀察。在一般情況下，細(xì)菌菌體多帶負(fù)電荷，易于和帶正電荷的堿性染料結(jié)合而被染色。因此，常用堿性染料進(jìn)行單染色，如美蘭、孔雀綠、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫和中性紅等。若使用酸性染料，多用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅等。使用酸性染料時(shí)，必須降低染液的PH值，使其呈現(xiàn)強(qiáng)酸性（低于細(xì)菌菌體等電點(diǎn)），讓菌體帶正電荷，才易于被酸性染料染色。

　　單染色一般要經(jīng)過涂片、固定、染色、水洗和干燥五個(gè)步驟。

　　染色結(jié)果依染料不同而不同：

　　石碳酸復(fù)紅染色液：著色快，時(shí)間短，菌體呈紅色。　　

　　美蘭染色液：著色慢，時(shí)間長，效果清晰，菌體呈蘭色。

　　草酸銨結(jié)晶染色液：染色迅速，著色深，菌體呈紫色。

　　２、革蘭氏染色法

　　革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。

　　細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（G—）。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進(jìn)行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)和球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。

　　革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差別，染色反應(yīng)不一樣。現(xiàn)在一般認(rèn)為革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度底，吸附染料差，易脫色，這是染色反應(yīng)的主要依據(jù)。

　　另外，陽性菌菌體等電點(diǎn)較陰性菌為低，在相同PH條件下進(jìn)行染色，陽性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時(shí)的條件要嚴(yán)格控制。例如，在強(qiáng)堿的條件下進(jìn)行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應(yīng)；PH很低時(shí)，則可都呈負(fù)反應(yīng)。此外，兩類菌的細(xì)胞壁等對(duì)結(jié)晶紫—碘復(fù)合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時(shí)間，脫色方法也應(yīng)嚴(yán)格控制。

　　革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟，具體操作方法是：

　　１）涂片固定。

　　２）草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。

　　３）自來水沖洗。

　　４）加碘液覆蓋涂面染1分鐘。

　　５）水洗，用吸水紙吸去水分。

　　６）加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色，30秒后水洗，吸去水分。

　　７）蕃紅梁色液（稀）染10秒鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。

　　染色的結(jié)果，革蘭氏正反應(yīng)菌體都呈紫色，負(fù)反應(yīng)菌體都呈紅色。